細胞增殖-毒性檢測試劑盒  Cell Counting Kit-8(CCK-8/CCK8)

產品簡介:

Cell Counting Kit-8 簡稱CCK-8 試劑盒，為MTT 法的替代方法，是一種基于WST(水溶性四唑鹽，化學名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽) ，是用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。

水溶性四唑（2-（2-甲氧基-4硝基ben）-3-(4-硝基ben)-5-（2,4-二磺基苯）-2H-四唑單鈉鹽），是一種類似于MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，被線粒體內的脫氫酶還原成橙黃色的水溶性的甲臜染料(formazan,下圖)， 這種甲臜染料直接溶解在培養(yǎng)基中。水溶性四唑被細胞內脫氫酶生物還原后生成的甲臜能夠。細胞增殖越多越快，則培養(yǎng)基的顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺。對于同樣的細胞，生成的甲臜物的數量與活細胞的數量成正比，顏色的深淺和細胞數目呈線性關系。正是利用這一特性開發(fā)的CCK-8試劑盒直接進行細胞增殖和毒性分析。CCK-8法應用非常廣泛，可以用于生物活性因子的活性檢測，抗腫瘤藥物的篩選，細胞增值的測定，細胞毒性檢測以及藥敏等與細胞活性和增殖相關的實驗。本試劑盒使用方便，試劑盒包含一管已經配制好的含有水溶性四唑的CCK-8溶液，即開即用，無需其他準備步驟。檢測過程也無需采用額外的步驟去溶解甲臜，可直接使用96孔板或者384孔板在酶標儀上檢測，適合大規(guī)模高通量的樣品檢測。

CCK-8法與MTT比較：

CCK8試劑盒提供了一種靈敏度高，操作簡便，使用安全，重現(xiàn)性好的細胞增殖與活性檢測方法。與傳統(tǒng)的MTT相比無需有機溶劑和放射性同位素，步驟少，無損失，結果準確！本試劑盒檢測非常便捷。試劑盒僅一管已經配制好的含有WST-8的CCK-8溶液，無須再進行任何配制等操作 。無須使用同位素，所有的檢測步驟僅在同一塊96孔板內完成。不必洗滌細胞，不必收集細胞，也不必采用額外的步驟去溶解formazan。可以用于大批量樣品的檢測。

1.MTT實驗生成的甲臜不是水溶性的，需要使用DMSO等有機溶劑溶解；而本方法產生的甲臜是水溶性的，不僅省去了溶解的步驟，更因此而減少了該操作步驟帶來的誤差。

2.與MTT方法相比，本方法線性范圍更寬，靈敏度更高。本方法對細胞無毒性，因此加入WST-8顯色后，可以在不同時間反復用酶標儀讀數多次測定從而找到zui佳測定時間。

3.本方法所用試劑在培養(yǎng)基中比MTT更加穩(wěn)定，實驗效果重復性好。

4.MTT具有毒性，同時其生成的甲臜需要有機溶劑溶解，會對操作人員身體造成危害。本試劑無毒，使用中無需有機溶劑，操作更加安全。

5.本試劑盒在4℃避光可長期保存，使用無需配制，即開即用。

6.酚紅和血清對CCK法的檢測不會造成干擾（扣除空白孔即可）

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常見問題與解答:

Q1.設定參比波長的目的是什么？必須要設定嗎？         

A1.不一定要設定。 CCK-8試劑在參比波長處沒有吸光度。設定參比波長的目的是為了去除由于樣品渾濁所帶來的吸收。

Q2.如何設定空白對照？

A2.在不含細胞的培養(yǎng)基中加入CCK-8，測定450 nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗 (細胞毒性實驗) 時，還應考慮藥物的吸收，可在不含細胞，加入藥物的培養(yǎng)基中測定450 nm的吸光度作為空白對照。

Q3.在做加藥實驗時，藥物對測定是否有影響？如何解決？

A3.有時會有影響。如果藥物具有氧化還原性，會和CCK-8發(fā)生反應，吸光度發(fā)生變化。解決辦法：首先要確認藥物是否有吸收，在含有藥物的培養(yǎng)基中加入CCK-8，測定450nm的吸光度，如果它的吸光度與不含藥物的培養(yǎng)基（加CCK-8）的吸光度相比有明顯變化，則證明藥物有影響，可在加CCK-8之前更換培養(yǎng)基，去掉藥物的影響。

Q4.不更換培養(yǎng)基加CCK-8試劑，有沒有問題？

A4.一般沒有問題。但是如果培養(yǎng)基里有氧化還原性物質的話，可能會產生誤差，必須更換其他培養(yǎng)基。我以下培養(yǎng)基會影響測定：培養(yǎng)基IMDM的空白吸收1.0；培養(yǎng)基McCoy/s的空白吸收0.3。

Q5.哪些物質會影響CCK-8的測定？

A5.當有還原性物質存在時會影響CCK-8的測定，增加O.D.值；在有氧化性物質存在時會抑制測定反應的發(fā)生，減小O.D.值；在有酚紅存在的情況下，會增加空白吸收，但不影響測定，扣除空白吸收即可；血清不影響測定。

Q6.說明書上僅寫了96孔板的測定方法，如果使用24孔板或12孔板，應該加多少量CCK-8試劑？

A6.一般情況下建議加入CCK-8試劑的量是培養(yǎng)基體積的1/10.

Q7如何減少由于CCK-8試劑在槍頭或者孔壁上的殘留所帶來的誤差 ？

A7.可以在加樣前用培養(yǎng)基稀釋CCK-8試劑并混勻后加樣。

Q8.每次測定的O.D值不一樣，是什么原因？如何解決？

A8.可能會有以下幾個原因：

1.當在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)時，培養(yǎng)板zui外一圈的孔zui容易干燥揮發(fā)，導致培養(yǎng)基的體積不一樣，從而增加誤差。一般情況下，zui外一圈的孔只加培養(yǎng)基，不作為測定孔用。

2.有可能會因為CCK-8沾在壁上而產生誤差，建議在加入CCK-8后，輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。

3.每孔的細胞數量過多或過少。請預先在1000-100000個/孔范圍內摸索條件。

Q9.在CCK-8顯色過程中，如何終止反應？ A9. 有以下幾種方法：注意: 反應停止后, 應在24小時內測定。

1)每孔加10ul0.1M HCI溶液。2)在顯色反應后，將培養(yǎng)板放入4℃冰箱內。3)每孔加10ul 1%(w/v)的SDS（十二烷基磺酸鈉）溶液。

Q10.在實驗中吸光度值太高，如果不能減少細胞數量，如何解決？

A10.縮短加入CCK-8后的培養(yǎng)時間。

Q11.必須預培養(yǎng)細胞嗎？

A11.不一定。如果要想保持細胞的zui好狀態(tài)，建議預培養(yǎng)細胞。如果不做細胞的預培養(yǎng)，細胞內的脫氫酶可能會不穩(wěn)定。也有研究人員不做細胞預培養(yǎng)，但在做標準曲線和檢測時需要統(tǒng)一檢測條件。

Q12.如果加入的藥物中有金屬，是否會有影響？

A12.金屬對CCK-8顯色有影響。終濃度為1mM的氯化亞鉛、Fecl3、硫酸銅會抑制5%、15%、90%的顯色反應，使靈敏度降低。如果終濃度是10mM的話，將會100%抑制。

Q13.CCK-8的保質期有多久？

A13.CCK-8在避光0-5℃的條件下可以存放1年，在-20℃下避光可以保存2年。如果需要長期保存，我們推薦在-20℃儲藏。正常的CCK-8顏色為淺粉色，如有明顯顏色變化，則CCK-8的質量有可能發(fā)生變化。CCK-8若反復凍融有可能會增加空白吸收，從而影響檢測結果，若短時間頻繁使用可將試劑存放在4℃冰箱內保存。

Q14.預培養(yǎng)后，更換培養(yǎng)基需要細胞計數嗎？

A14.一般情況下用胰蛋白酶處理對數增長期的細胞，用血球計數盤計數，制備成一定濃度的細胞懸液即可。如果想要計數細胞，可以預培養(yǎng)后去培養(yǎng)基用血球計數盤進行計數。

Q15.CCK-8是否對細胞進行染色？

A15.CCK-8不對細胞進行染色。培養(yǎng)基中的CCK-8并不進入細胞內染色細胞，而是在電子載體的作用下被細胞中的脫氫酶還原為高度水溶性的黃色甲臜染料，是一個顯色反應。顯色反應后，更換新的培養(yǎng)基，可以繼續(xù)培養(yǎng)細胞。

Q16.CCK-8對于不同的細胞，靈敏度是否一樣？

A16.不同細胞的脫氫酶活性不一樣，顯色程度不一樣，靈敏度也不一樣。

Q17.懸浮細胞和貼壁細胞在接種數量上有何區(qū)別？

A17.大部分懸浮細胞相比貼壁細胞比較難顯色，O.D.值偏低，一般需要增加細胞接種數量或延長加入CCK-8后的培養(yǎng)時間。貼壁細胞顯色比較容易，若細胞數量過大，有時吸光度會超過酶標儀的讀數。

Q18.應該每次做標準曲線嗎？

A18.建議每次做。雖然細胞是一樣的，但是細胞的狀態(tài)不一定一樣。對于狀態(tài)不一樣的細胞，建議每次做標準曲線。如果試劑的批號不一樣，靈敏度可能會有輕微的差異，對于不同的批號建議分別做標準曲線。

Q19.有時在藥物作用情況下，細胞已經死亡，但是脫氫酶的活性還在，是否能計算細胞數量？

A19.不能。由于CCK-8是通過和細胞內的脫氫酶進行反應間接反映活細胞數量，如果細胞已經死亡，但脫氫酶的活性還在，則實際測定的活細胞數量將會比真實值高，不能真實反應活細胞數量，建議采用別的方法測定。

Q20.CCK-8是什么顏色？   

A20.應該是粉紅色。若顏色不一樣，有可能會影響測定。

Q21.導入基因后，是否用CCK-8來檢測活細胞？    

A21.可以

Q22.在pH5的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，是否可以用CCK-8試劑檢測？

A22.理論上可以的，但是需要做標準曲線進一步確定。

Q23.O.D.值在什么范圍比較合適？

A23.一般情況下O.D.值在0.1-2.0范圍內都可以，在1.0附近較好。

Q24.細菌是否會和CCK-8試劑發(fā)生反應？

A24.CCK-8不會和細菌發(fā)生顯色反應。細菌防御系統(tǒng)強，不會發(fā)生還原反應

Q25.CCK-8試劑用于測定活細胞的數量，對于增殖期的細胞和靜止期的細胞，有何影響？A25.一般情況下CCK-8試劑用于檢測對數生長期的細胞。如果靜止期細胞的脫氫酶活性和增殖期的細胞的脫氫酶活性有很大的 不同的話，則兩者會有很大的差別。

Q26.如果O.D.值太低，可以采取什么辦法？

A26.兩個辦法：1)適當增加細胞數量; 2)延長加入CCK-8后的反應時間。

Q27.在做藥物毒性實驗時，加入CCK-8培養(yǎng)一段時間后，檢測時顏色沒有變化，樣品和空白O.D.值一樣，是何原因？

A27.可能因素有2個：藥物的濃度太高，細胞全部被殺死；如果藥物有氧化性，則會抑制CCK-8試劑的顯色反應，可以采取先更換培養(yǎng)基清洗掉藥物，然后再加CCK-8試劑進行檢測的方法。

Q28.如何避免細胞聚團現(xiàn)象？

A28. 1) 消化時間長一些。2) 細胞培養(yǎng)好后，手搖或設備搖勻。3)用槍頭反復吹打，但要避免產生氣泡。

Q29.做懸浮細胞的實驗時，檢測幾天比較合適？

A29.由于不更換培養(yǎng)基長時間的培養(yǎng)，培養(yǎng)基中的氧氣和營養(yǎng)會流失，會影響細胞的狀態(tài)。建議培養(yǎng)4-5天左右，但要確定細胞數量是否已經達到飽和？如果需要長時間培養(yǎng)，因為容易蒸發(fā)，建議培養(yǎng)板的邊緣孔不加細胞。

Q30.如何制作標準曲線？

A30.先取已知細胞數量的細胞懸液加入到培養(yǎng)板中，然后用培養(yǎng)基一次等比例稀釋成一個系列濃度的細胞懸液，細胞培養(yǎng)一段時間后加CCK-8試劑，培養(yǎng)一段時間，等顏色發(fā)生明顯變化后，用酶標儀進行測定，以細胞數量為X軸，O.D.值為Y軸，就可以做成一條標準曲線。

Q31.細胞數量太多會有什么結果？

A31.貼壁細胞如果接種太多，細胞在培養(yǎng)過程中容易長滿而產生互相擠壓的現(xiàn)象，導致細胞狀態(tài)不好或者死亡。另外細胞接種太多容易產生O.D.值過高（甚至于超過儀器的檢測范圍）的情況。

Q32.BrdU法和CCK-8法有何區(qū)別？

A32.CCK-8法師通過檢測對數生長期的細胞內的脫氫酶來反映細胞的活性，而BrdU法是檢測細胞的DNA合成。CCK-8法只需要加入知己，通過比色法就可以檢測，而BrdU法不僅要加入試劑，而且要固定細胞，通過抗原抗體反應之后用發(fā)光法來檢測。兩者的原理是*不同的。如果只是檢測細胞增殖的話，那么CCK-8的方法是比較簡單的。

Q33.在做藥物毒性實驗時，藥物對細胞有抑制作用，但檢測結果卻是O.D.值升高，為什么？

A33.很可能藥物和CCK-8試劑發(fā)生了反應，可以做一個只加藥物的空白對照，如果O.D.值確實比正常的空白對照O.D.值高很多，則說明藥物和CCK-8試劑發(fā)生了反應?？梢酝ㄟ^更換培養(yǎng)基清洗掉藥物的辦法解決。

Q34.加入CCK-8試劑后，為什么在不同時間檢測的值不一樣（例如在3小時和在3.5小時）？ A34.由于CCK-8試劑和細胞內的脫氫酶反應是一個循環(huán)反應，隨著時間的增加，O.D.值也會不斷增加，顏色會不斷加深，但細胞數量卻沒有什么太大變化。一般情況下建議在確定zui佳的實驗條件（合適的時間、合適的O.D.值）后，把加入CCK-8試劑后的培養(yǎng)時間固定下來，以后在同樣的培養(yǎng)時間點進行檢測。

Q35.組內數據差異比較大或組間數據雜亂，沒有規(guī)律，是何原因？

A35.原因有可能是CCK-8試劑在移液槍的槍頭上或培養(yǎng)板的孔壁上殘留，加入時zui好快速加入以避免殘留，可以用培養(yǎng)基稀釋CCK-8試劑的辦法來降低誤差：用培養(yǎng)基稀釋CCK-8試劑1倍，混勻后每孔加20ul使用。

Q36.用CCK-8試劑做細胞毒性檢測時：1）貼壁細胞預培養(yǎng)多長時間合適？2）預培養(yǎng)過程中細胞分裂，如何計算細胞數量？3）如果預培養(yǎng)時間太長，會有什么結果？

A36. 一般情況下建議貼壁細胞預培養(yǎng)的時間為24h. 如果只計算藥物的LD50值的話,可不必考慮預培養(yǎng)過程中的細胞分裂問題,但要做一個加細胞的對照(該值為zui大值)。 如果預培養(yǎng)時間太長，有可能細胞會增長過多，達到飽和狀態(tài)，O.D.值將會很高，甚至會超過儀器的檢測范圍。

Q37.在實驗中加入刺激細胞增長的因子，但是細胞數量卻沒有增加（或者吸光值沒有上升），為什么？

A37.首先用顯微鏡觀察一下，確定細胞數量是否增加？然后才考慮其他的因素（如果加入的刺激因子和CCK-8發(fā)生反應的話，吸光值不變這種可能性是非常低的）。如果顯微鏡下觀察細胞數量確實增加了，則請檢查加入的藥物是否具有氧化性？有可能抑制了CCK-8試劑的反應。方法是：在有細胞的培養(yǎng)基中做1個加藥物和不加藥物的對比，然后分別加入CCK-8試劑進行檢測，如果不加藥物的O.D.值比加藥物的O.D.值高，則說明藥物確實具有氧化性，產生了干擾。

Q38. Cell Counting Kit-8法實驗中每孔應該接種多少細胞？ 

A.38貼壁細胞每孔至少需要接種1,000個細胞 (100 mL的培養(yǎng)基)，檢測白細胞時由于它的靈敏度較低，每孔至少需要接種2,500個細胞 (100 mL的培養(yǎng)基)，建議先做幾個孔摸索接種細胞的數量。如果要使用24孔板或是6孔板實驗，請先計算每孔相應的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK-8溶液。

Q39.  哪些物質會影響CCK-8的測定？

A39. 當有還原性物質存在時會影響CCK-8的測定，增加OD值，例如含有維生素C的Glucose等 (一般培養(yǎng)基中的量不多，酚紅或血清不影響測定 )。在有酚紅存在的情況下，會增加空白吸收，但不影響測定，扣除空白吸收即可。

Q40. 在做加藥實驗時，藥物對測定是否有影響？如何解決？ 

A40有時會有影響。如果藥物具有還原性，會和CCK-8試劑發(fā)生顯色反應，增加吸光度。解決辦法：首先要確認藥物是否有吸收，在含有藥物的培養(yǎng)基中加入CCK-8，測定450 nm的吸光度，如果它的吸光度比不含藥物的培養(yǎng)基 (只加CCK-8) 的吸光度高，則證明藥物有影響，可在加CCK-8之前更換培養(yǎng)基，去掉藥物的影響。

Q41. CCK-8對細胞是否有毒？ 

CCK-8對細胞的毒性相當低。 CCK8溶液自身因為高濃度的1Methoxy PMS的存在而具有一點毒性。但是，加到培養(yǎng)基中的CCK8是沒有毒性的，因為被稀釋了10倍。因此，長時間的培養(yǎng)，如過夜或者培養(yǎng)數天是可以的。同一個細胞培養(yǎng)液在CCK8檢測后還可以用于其他細胞增殖檢測，如結晶紫檢測，中性紅檢測或者DNA熒光檢測等。由于每種細胞對于CCK8的耐受力都不同，因此在需要進行長時間培養(yǎng)時，先檢測一下細胞在加入CCK8培養(yǎng)后的活力。

Q42.. Cell Counting Kit-8試劑穩(wěn)定嗎？

A42. CCK-8在避光0～5℃的條件下可以存放1年，在-20度下避光可以保存2年。反復解凍和冰凍將會增加空白吸收，從而影響檢測結果，若經常使用可將試劑存放在4℃冰箱內保存。 在常溫下可以保存3周左右，顏色應該為淺紅色，如果顏色發(fā)生改變，則可能會增加空白吸光度。

Q43.  我沒有450 nm的濾光片，還可以使用哪些其他的濾光片？ 

A43可以使用吸光度在430～490 nm之間的濾光片，但是450 nm濾光片的檢測靈敏度zui高。

Q44. CCK-8能否對活細胞進行染色?

A44不能。因為CCK-8的主要成分是一種水溶性的四唑鹽，并通過電子載體將活細胞中的電子交換到培養(yǎng)基中的CCK上，因為CCK及其生成的甲瓚染料是高度水溶性的，不會進入細胞內，所以CCK-8不能對活細胞進行染色。

Q45. 如果OD值太低，可以采取什么辦法？

可以采取2個辦法：  適當增加細胞數量和 延長加入CCK試劑后的染色時間。