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技術(shù)文章

當(dāng)前位置:首頁技術(shù)文章游離蛋白S檢測試劑盒 (ADI)

游離蛋白S檢測試劑盒 (ADI)

更新時(shí)間:2014-12-08點(diǎn)擊次數(shù):1451

AAmerican Diagnostica GmbH,ADI 公司

 

Freee Protein S ELISA (Cat.no 842)中文說明書

                                         中文說明書供參考,請(qǐng)以英文說明書為準(zhǔn)

簡介,檢測原理(略)

試劑盒組成:

  1. 96孔板
  2. 2Protein S 樣品稀釋液,即用型50ml
  3. 3Protein S校準(zhǔn)品
  4. 1Protein S高值質(zhì)控
  5. 1Protein S低值質(zhì)控
  6. 3瓶抗人Protein S-HRP 二抗
  7. Protein S二抗稀釋液(15ml
  8. 1瓶,20X洗滌液(50ml)
  9. 1TMB底物溶液 25ml
  10. 1瓶終止液(6ml

試劑準(zhǔn)備和保存

  1. 微孔板:鋁鉑拆開后,板條應(yīng)該在30min內(nèi)使用。不用的板條按2-8在原包裝袋內(nèi)(含干燥劑)密封,防潮可保存4周。
  2. Protein S樣品稀釋液即用型,一旦開蓋,2-8度可穩(wěn)定4周。
  3. 校準(zhǔn)品:每瓶校準(zhǔn)品,用Protein S 樣品稀釋液2ml重懸。校準(zhǔn)品含量相當(dāng)于正常血漿1:50稀釋后的量。重懸后的校準(zhǔn)品室溫(18-25)可保存8小時(shí)。
  4. Protein S Control I:用濾過的去離子水0.5ml重懸該質(zhì)控品。重懸后的質(zhì)控品室溫(18-25)可保存8小時(shí),2-8可保存24小時(shí),-20無菌條件可保存2月。
  5. Protein S Control II:用濾過的去離子水0.5ml重懸該質(zhì)控品。重懸后的質(zhì)控品室溫(18-25)可保存8小時(shí),2-8可保存24小時(shí),-20無菌條件可保存2月。
  6. Mab anti-Human Free Protein S-HRP:用4ml Protein S Conjugate Diluent,重懸該抗體。輕搖,重懸后的二抗室溫可保存24小時(shí),2-8度可保存4周以上。
  7. Protein S Conjugate Diuent:即用型,開蓋后,2-8度可保存4周以上。
  8. Protein S Wash Solution:如果瓶內(nèi)有沉淀或固體物質(zhì),37度水浴15-30min,輕搖瓶管,1:20用雙蒸水稀釋(50ml,稀釋后可制備1L的稀釋液)原管內(nèi)2-8度保存,開蓋后后保存4周,稀釋后的稀釋液,2-8度可保存7天。
  9. TMB顯色底物:即用型,一旦開蓋,2-8度可保存4周以上。
  10. 終止液(0.45M H2SO4):即用型。

樣品收集和制備

檸檬酸抗凝的血小板缺乏的血漿或血清適用于該實(shí)驗(yàn)。

血漿按以下方式制備:

  1. 按血:檸檬酸鈉(3.2%=9:1的比例,收集樣本
  2. 2500g 離心20min
  3. 血漿需2-8度保存,4小時(shí)內(nèi)做檢測?;蜓獫{保存于-20度,6個(gè)月內(nèi)檢測。
  4. 凍的血漿需37度,迅速解凍。解凍的血漿2-8度保存,4小時(shí)內(nèi)做檢測。

檢測的樣本和Protein S control需用protein S 樣品稀釋液1:50稀釋,如果樣品濃度可能高于100%,需做高濃度稀釋。如果樣本濃度x10%,樣本只需做小于1:50低濃度稀釋

校準(zhǔn)品制備

Free Protein S 濃度以占血漿百分比(%)表示,。100% Free Protein S濃度相當(dāng)于:正常血漿(混合池)1:50稀釋后的濃度。

按一下方式制備校準(zhǔn)品:

Free Protein S%

C

C/2

C/4

C/10

C/20

0

校準(zhǔn)品加入量

1ml

0.5 ml

0.25 ml

0.1 ml

0.05 ml

0

校準(zhǔn)品稀釋液加入量

0 ml

0.5 ml

0.75 ml

0.90 ml

0.95 ml

1.0 ml

充分混勻,標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液室溫穩(wěn)定性至少4個(gè)小時(shí)(18-25

操作流程:

  1. 依據(jù)做的標(biāo)本數(shù)量,拆去多余的板條,置于提供的板條架上。
  2. 剩余檢測孔,按以下操作流程操作。

試劑

加入量

流程

Anti-Human Free Protein S-HRP

100ul

每孔加入100ul Anti-Human Free Protein S-HRP

Protein S Standard diluted sample Protein S sample diuent(blank)

100ul

立即加入100ul ProteinS 標(biāo)準(zhǔn)品和檢測樣本至對(duì)應(yīng)孔

室溫(18-25)孵育1小時(shí)(手動(dòng)輕震板或振板器振板)

Protein S 稀釋液

300ul

洗板5

TMB底物顯色液

200ul

洗滌完畢后,立即每孔加入200ul底物顯色液

室溫(18-25)孵育5min()

0.45M H2SO4

50ul

加入0.45M H2SO4終止液

等待10min待顏色穩(wěn)定,450nm測定吸光度,減去空白吸光度。

注意:

  1. 在孵育的時(shí)候,特別是顯色的時(shí)候,避免微孔板強(qiáng)光照射。
  2. 在加入試劑前或洗滌前,不要使板干透。隨后加入的時(shí)間應(yīng)在3min內(nèi)完成,避免微孔板太干燥。如果已干燥,在加入新試劑前,需加入洗滌液,然后去掉。
  3. 每排板孔,加入TMB底物的時(shí)間間隔需要測定。終止時(shí)間要相同

結(jié)果:

Protein S 標(biāo)準(zhǔn)品濃度(%)做橫坐標(biāo),平均吸光度做縱坐標(biāo),每次檢測都需要重新做標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖所示。

計(jì)算:

從曲線可直接計(jì)算出ProteinS 的濃度(樣品按:1:50稀釋)。如果樣品做了高濃度的稀釋,需乘以對(duì)應(yīng)稀釋系數(shù)D(例如:樣本做了1:100稀釋后,測值需乘以2,1:200稀釋后,測值需乘以4) 。如果做低濃度的稀釋,得到的檢測值需除以稀釋倍數(shù)。

 

檢測程序的局限性:

因?yàn)楹凶觾?nèi)的單抗是鈣依賴性單抗,所以請(qǐng)用盒子里自帶的Wash Buffer (含鈣)。如果洗滌不充分,得到的樣品檢測OD值會(huì)很高,為避免非特異性顯色,請(qǐng)確保洗滌的充分性。

測值:
血漿中Protein S 濃度正常值:60-150%,因此非正常值<60%。一般男性測值會(huì)高于女性,且隨年齡和血脂濃度增加。

 

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