第三章 細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法

*節(jié) 培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)

一、基本概念通常，體外培養(yǎng)的生物成分無外乎兩種結(jié)構(gòu)形式：

其一是小塊組織或稱為組織塊（tissue block），一般稱為外植塊；
其二是將生物組織分散后制成的單個(gè)細(xì)胞，一般稱為分離的細(xì)胞(isolated cell)或者分散的細(xì)胞(dissociated cell)。

分散的過程通常在培養(yǎng)液或平衡鹽溶液中進(jìn)行，分散的細(xì)胞被懸浮于培養(yǎng)液或平衡鹽溶液中。

單個(gè)細(xì)胞分散存在于培養(yǎng)液或其它平衡鹽溶液中、緩沖溶液中，就稱為細(xì)胞懸液(cell suspension)。

狹義的細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)主要是指分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)，廣義的細(xì)胞培養(yǎng)的概念還包括單（個(gè)）細(xì)胞培養(yǎng)(single cell culture)。一種是群體培養(yǎng)（mass culture），將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞貼壁生長，匯合（confluence）后形成均勻的單細(xì)胞層；另一種是克隆培養(yǎng)（clonal culture），將高度稀釋的游離細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，各個(gè)細(xì)胞貼壁后，彼此距離較遠(yuǎn)，經(jīng)過生長增殖每一個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)細(xì)胞集落，稱為克?。?/span>clone）。一個(gè)細(xì)胞克隆中的所有細(xì)胞均來源于同一個(gè)祖先細(xì)胞。

現(xiàn)今，用于疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞基本有3類，即原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞株及傳代細(xì)胞系。經(jīng)過幾十年的研究和發(fā)展，目前我國已經(jīng)擁有了可以進(jìn)行大規(guī)模疫苗生產(chǎn)的動(dòng)物原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞和Vero細(xì)胞等生產(chǎn)技術(shù)，用于生產(chǎn)多種人用、動(dòng)物疫苗。其中二倍體細(xì)胞（如我國70年代建立的人胚肺二倍體細(xì)胞株KMB17和2BS）對多種病毒具有廣泛的敏感性，用其制備病毒性疫苗可以克服使用原代細(xì)胞時(shí)在其培養(yǎng)物中可能存在的各種潛在致病因子的危險(xiǎn)，是當(dāng)前病毒性疫苗生產(chǎn)較為理想的細(xì)胞基質(zhì)。Vero細(xì)胞是1962年由日本Chiba大學(xué)的Yasumura等人從成年非洲綠猴腎中分離獲得的，是一種貼壁依賴性成纖維細(xì)胞，核型為2n 60，高倍體率約為1.7%，可持續(xù)地進(jìn)行培養(yǎng)，不含任何污染因子。通常使用199培養(yǎng)基添加5%胎牛血清進(jìn)行培養(yǎng)。該細(xì)胞可用于多種病毒的增殖，已被WHO批準(zhǔn)廣泛用于人用、動(dòng)物用疫苗生產(chǎn)。

二、體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型

（一）貼附型：大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細(xì)胞，大致分成以下四型：

1、成纖維細(xì)胞型：胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長時(shí)呈放射狀。除真正的成纖維細(xì)胞外，凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織，如心肌、平滑肌、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮等常呈本型狀態(tài)。培養(yǎng)中細(xì)胞的形態(tài)與成纖維類似時(shí)皆可稱之為成纖維細(xì)胞。

2、上皮型細(xì)胞：細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央有圓形核，細(xì)胞彼此緊密相連成單層膜。生長時(shí)呈膜狀移動(dòng)，處于膜邊緣的細(xì)胞總與膜相連，很少單獨(dú)行動(dòng)。起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。

3、游走細(xì)胞型：呈散在生長，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運(yùn)動(dòng)，方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時(shí)難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。

4、多型細(xì)胞型：有一些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。

（二）懸浮型:見于少數(shù)特殊的細(xì)胞，如某些類型的癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長。這類細(xì)胞容易大量繁殖。

三、培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程:體內(nèi)細(xì)胞生長在動(dòng)態(tài)平衡環(huán)境中，而組織培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或其它容器，生存空間和營養(yǎng)是有限的。當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，則需要分離出一部分細(xì)胞和更新營養(yǎng)液，否則將影響細(xì)胞的繼續(xù)生存，這一過程叫傳代（Passage或Subculture）。每次傳代以后，細(xì)胞的生長和增殖過程都會(huì)受一定的影響。另外，很多細(xì)胞在體外的生存也不是無限的，存在著一個(gè)發(fā)展過程。所有這一切，使組織細(xì)胞在培養(yǎng)中有著一系列與體內(nèi)不同的生存特點(diǎn)。

（一）培養(yǎng)細(xì)胞生命期（Life Span of Culture Cells）:所謂培養(yǎng)細(xì)胞生命期，是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時(shí)間。體內(nèi)組織細(xì)胞的生存期與完整機(jī)體的死亡衰老基本相一致。人胚二倍體成纖維細(xì)胞培養(yǎng)，在不凍存和反復(fù)傳代條件下，可傳30～50代，相當(dāng)于150～300個(gè)細(xì)胞增殖周期，能維待一年左右的生存時(shí)間，zui后衰老凋亡（Apoptosis）。如供體為成體或衰老個(gè)體，則生存時(shí)間較短；如培養(yǎng)的為其它細(xì)胞,如肝細(xì)胞或腎細(xì)胞，生存時(shí)間更短，僅能傳幾代或十幾代。只有當(dāng)細(xì)胞發(fā)生遺傳性改變，如獲永生性或惡性轉(zhuǎn)化時(shí)，細(xì)胞的生存期才可能發(fā)生改變。正常細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，不論細(xì)胞的種類和供體的年齡如何，在細(xì)胞全生存過程中，大致都經(jīng)歷以下三個(gè)階段：

1．原代培養(yǎng)（Primary Culture）期：也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到*次傳代階段，一般持續(xù)1一4周。此期細(xì)胞呈活躍的移動(dòng)，可見細(xì)胞分裂，但不旺盛。初代培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)上相似性大。細(xì)胞群是異質(zhì)的（Heterogeneous），也即各細(xì)胞的遺傳性狀互不相同，細(xì)胞相互依存性強(qiáng)。

2．傳代期：初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系（Cell Line）。在全生命期中此期的持續(xù)時(shí)間zui長。在培養(yǎng)條件較好情況下，細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細(xì)胞稱二倍體細(xì)胞系（Diploid Cell Line）。為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。當(dāng)前世界上常用細(xì)胞均在不出十代內(nèi)凍存。如不凍存，則需反復(fù)傳代以維持細(xì)胞的適宜密度，以利于生存。但這樣就有可能導(dǎo)致細(xì)胞失掉二倍體性質(zhì)或發(fā)生轉(zhuǎn)化。一般情況下當(dāng)傳代10～50次左右，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以至*停止，細(xì)胞進(jìn)入第三期。

3．衰退期：此期細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，zui后衰退凋亡。
在細(xì)胞生命期階段，少數(shù)情況下，在以上三期任何一點(diǎn)（多發(fā)生在傳代末或衰退期），由于某種因素的影響，細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化（Spontaneous Transformation）。轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細(xì)胞可能獲得永生性（Immortality）或惡性性（Malignancy）。細(xì)胞永生性也稱不死性，即細(xì)胞獲持久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱無限細(xì)胞系（Infinite Cell Line），也稱連續(xù)細(xì)胞系（Continuous Cell Line）。無限細(xì)胞系的形成主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細(xì)胞獲不死性后，核型大多變成異倍體（Heteroploid）。細(xì)胞轉(zhuǎn)化亦可用人工方法誘發(fā)，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞也可能具有惡性性質(zhì)。細(xì)胞永生性和惡性性非同一性狀。

（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期 所有體外培養(yǎng)細(xì)胞，包括初代培養(yǎng)及各種細(xì)胞系，當(dāng)生長達(dá)到一定密度后，都需做傳代處理。傳代的頻率或間隔與培養(yǎng)液的性質(zhì)、接種細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞增殖速度等有關(guān)。接種細(xì)胞數(shù)量大、細(xì)胞基數(shù)大、相同增殖速度條件下，細(xì)胞數(shù)量增加與飽和速度相對要快（實(shí)際上細(xì)胞接種數(shù)量大時(shí)細(xì)胞增殖速度比時(shí)要快）。連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞系比初代培養(yǎng)細(xì)胞增殖快，培養(yǎng)液中血清含量多時(shí)細(xì)胞增殖比少時(shí)快。以上情況都會(huì)縮短傳代時(shí)間。

所謂細(xì)胞“一代"一詞，系僅指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時(shí)的一段時(shí)間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說法，它與細(xì)胞倍增一代非同一含義。如某一細(xì)胞系為第153代細(xì)胞，即指該細(xì)胞系已傳代153次。它與細(xì)胞世代（Generation）或倍增〔Doubling〕不同；在細(xì)胞一代中，細(xì)胞能倍增3～6次。

細(xì)胞傳一代后，一般要經(jīng)過以下三個(gè)階段：

1．潛伏期（Latent Phase）：細(xì)胞接種培養(yǎng)后，先經(jīng)過一個(gè)在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時(shí)細(xì)胞胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。接著是細(xì)胞附著或貼附于底物表面上，稱貼壁，懸浮期結(jié)束。各種細(xì)胞貼附速度不同，這與細(xì)胞的種類、培養(yǎng)基成分和底物的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。初代培養(yǎng)細(xì)胞貼附慢，可長達(dá)10～24小時(shí)或更多；連續(xù)細(xì)胞系和惡性細(xì)胞系快，10～30分鐘即可貼附。細(xì)胞貼附現(xiàn)象是一個(gè)非常復(fù)雜和與多種因素相關(guān)的過程。支持物能影響細(xì)胞的貼附；底物表面不潔不利貼附，底物表面帶有陽性電荷利于貼附。另外在貼附過程中，有一些特殊物質(zhì)如纖維連接素（Fibronectin），又稱LETS（Larger External Transformation Substance），細(xì)胞表面蛋白（Cell Surface Protein：CSP）等也參與貼附過程。這些物質(zhì)都是蛋白類成分，它們有的存在于細(xì)胞膜的表面（如CSP），有的則來自培養(yǎng)基中的血清（LETS）。近年又從各種不同組織和生物成分中提取出了很多促貼附物質(zhì)。貼附是貼附類細(xì)胞生長增殖條件之一。

細(xì)胞貼附于支持物后，除先經(jīng)過前述延展過程變成極性細(xì)胞，還要經(jīng)過一個(gè)潛伏階段，才進(jìn)入生長和增殖期。細(xì)胞處在潛伏期時(shí)，可有運(yùn)動(dòng)活動(dòng)，基本無增殖，少見分裂相。細(xì)胞潛伏期與細(xì)胞接種密度、細(xì)胞種類和培養(yǎng)基性質(zhì)等密切相關(guān)。初代培養(yǎng)細(xì)胞潛伏期長，約24～96小時(shí)或更長，連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期短，僅6～24小時(shí)；細(xì)胞接種密度大時(shí)潛伏期短。當(dāng)細(xì)胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時(shí)，標(biāo)志細(xì)胞已進(jìn)入指數(shù)增生期。

2．指數(shù)增生期（Logarithmic growth Phase）：這是細(xì)胞增值zui旺盛的階段，細(xì)胞分裂相增多。指數(shù)增生期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長旺盛與否的一個(gè)重要標(biāo)志。一般以細(xì)胞分裂（Mitotic Index：MI）表示，即細(xì)胞群中每1000個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。體外培養(yǎng)細(xì)胞分裂指數(shù)受細(xì)胞種類、培養(yǎng)液成分、pH、培養(yǎng)箱溫度等多種因素的影響。一般細(xì)胞的分裂指數(shù)介于0.1%～0.5%，初代細(xì)胞分裂指數(shù)低，連續(xù)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分裂指數(shù)可高達(dá)3%～5%。pH和培養(yǎng)液血清含量變動(dòng)對細(xì)胞分裂指數(shù)有很大影響。指數(shù)增生期是細(xì)胞一代中活力的時(shí)期，因此是進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)的和zui主要的階段。在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù)3～5天后，隨細(xì)胞數(shù)量不斷增多、生長空間漸趨減少、zui后細(xì)胞相互接觸匯合成片。細(xì)胞相互接觸后，如培養(yǎng)的是正常細(xì)胞，由于細(xì)胞的相互接觸能抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，這種現(xiàn)象稱接觸抑制（Contact Inhibition）。而惡性細(xì)胞則無接觸抑制現(xiàn)象，因此接觸抑制可作為區(qū)別正常與癌細(xì)胞標(biāo)志之一。腫瘤細(xì)胞由于無接觸抑制能繼續(xù)移動(dòng)和增殖，導(dǎo)致細(xì)胞向三維空間擴(kuò)展，使細(xì)胞發(fā)生堆積（Piled up）。細(xì)胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營養(yǎng)充分，細(xì)胞仍然能夠進(jìn)行增殖分裂，因此細(xì)胞數(shù)量仍在增多。但當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時(shí)，細(xì)胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制（Density Inhibition），導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。因此細(xì)胞接觸抑制和密度抑制是兩個(gè)不同的概念，不應(yīng)混淆。

3．停滯期（Stagnate Phase）：細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后，細(xì)胞遂停止增殖，進(jìn)入停滯期。此時(shí)細(xì)胞數(shù)量不再增加，故也稱平頂期（Plateau）。停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動(dòng)，繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累、pH降低。此時(shí)需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細(xì)胞會(huì)中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡，故傳代應(yīng)越早越好。傳代過晚（已有中毒跡象）能影響下一代細(xì)胞的機(jī)能狀態(tài)。在這種情況下，雖進(jìn)行了傳代，因細(xì)胞已受損，需要恢復(fù)，至少還要再傳1～2兩代，通過換液淘汰掉死細(xì)胞和使受損輕微的細(xì)胞得以恢復(fù)后，才能再用。結(jié)果反而耽誤了時(shí)間，這是在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)特別注意的。

四、原代培養(yǎng):即*次培養(yǎng)，是指將培養(yǎng)物放置在體外生長環(huán)境中持續(xù)培養(yǎng)，中途不分割培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程。有幾方面含義：

●培養(yǎng)物一經(jīng)接種到培養(yǎng)器皿（瓶）中就不在分割，任其生長繁殖；
●原代培養(yǎng)中的“代"并非細(xì)胞的“代"數(shù)，因?yàn)榕囵B(yǎng)過程中細(xì)胞經(jīng)多次分裂已經(jīng)產(chǎn)生多代子細(xì)胞；
●原代培養(yǎng)過程中不分割培養(yǎng)物不等于不更換培養(yǎng)液，也不等于不更換培養(yǎng)器皿。

正常細(xì)胞培養(yǎng)的世代數(shù)有限，只有癌細(xì)胞和發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞才能無限生長下去。所謂轉(zhuǎn)化即是指正常細(xì)胞在某種因子的作用下發(fā)生突變而具有癌性的細(xì)胞。目前世界上許多實(shí)驗(yàn)室所廣泛傳用的HeLa細(xì)胞系就是1951年從一位名叫Henrietta Lacks的婦女身上取下的宮頸癌細(xì)胞培養(yǎng)而成。此細(xì)胞系一直延用至今。

原代培養(yǎng)的細(xì)胞一般傳至10代左右就不易傳下去了，細(xì)胞的生長就會(huì)出現(xiàn)停滯，大部分細(xì)胞衰老死亡。但是有極少數(shù)的細(xì)胞能夠度過“危機(jī)"而繼續(xù)傳下去，這些存活的細(xì)胞一般能夠傳到40～50代，這種傳代細(xì)胞叫做細(xì)胞株。細(xì)胞株的遺傳物質(zhì)沒有發(fā)生改變,在培養(yǎng)過程中其特征始終保持。當(dāng)細(xì)胞株傳至50代以后又會(huì)出現(xiàn)“危機(jī)"，不能再傳下去。但是有部分細(xì)胞的遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變，并且?guī)в邪┳兊奶攸c(diǎn)，有可能在培養(yǎng)條件下無限制地傳代下去，這種傳代細(xì)胞稱為細(xì)胞系。

原代培養(yǎng)是建立各種細(xì)胞系（株）必經(jīng)的階段，其是否成功與組織污染與否、供體年齡、培養(yǎng)技術(shù)和方法、適宜培養(yǎng)基的選擇等多種因素有關(guān)。由于原代培養(yǎng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化性極小，對病毒敏感性好，因此適應(yīng)制備疫苗等生物制品；但也存在有潛在外源因子、不能事先檢查標(biāo)本、且受供體年齡健康狀況的影響而導(dǎo)致批間差異大等缺陷。目前常用的原代細(xì)胞培養(yǎng)有雞胚成纖維細(xì)胞及豬腎、猴腎、地鼠腎等原代細(xì)胞。

原代培養(yǎng)的基本過程包括取材、培養(yǎng)材料的制備、接種、加培養(yǎng)液、置培養(yǎng)條件下培養(yǎng)等步驟，在所有的操作過程中，都必須保持培養(yǎng)物及生長環(huán)境的無菌。

多數(shù)情況下，分散的細(xì)胞若屬于貼壁依賴型細(xì)胞，就能黏附、鋪展于培養(yǎng)器皿和載體表面生長而形成細(xì)胞單層，這種培養(yǎng)方式稱為單層細(xì)胞培養(yǎng)（monolayer culture），又叫貼壁培養(yǎng)（adherent culture）。少數(shù)情況下，培養(yǎng)的細(xì)胞沒有貼壁依賴性，可通過專門設(shè)備使細(xì)胞始終處于懸狀態(tài)而在體外生長，這種形式稱為懸浮培養(yǎng)（suspension culture）。如何讓接種的細(xì)胞盡快貼壁，是決定培養(yǎng)成功的關(guān)鍵步驟：

●取決于適當(dāng)?shù)纳L基質(zhì)表面；
●可降低接種后培養(yǎng)液對細(xì)胞的浮力，如先少補(bǔ)加少量培養(yǎng)液，待細(xì)胞貼壁后再補(bǔ)足營養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；
●注意適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種密度，一般105個(gè)/ml左右。

五、傳代培養(yǎng):當(dāng)原代培養(yǎng)成功以后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長和細(xì)胞不斷分裂，一則細(xì)胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制，生長速度減慢甚至停止；另一方面也會(huì)因營養(yǎng)物不足和代謝物積累而不利于生長或發(fā)生中毒。此時(shí)就需要將培養(yǎng)物分割成小的部分，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿（瓶）內(nèi)，再進(jìn)行培養(yǎng)。這個(gè)過程就稱為傳代（passage）或者再培養(yǎng)（subculture）。對單層培養(yǎng)而言，80%匯合或剛匯合的細(xì)胞是較理想的傳代階段。

體外培養(yǎng)技術(shù)中所謂的傳“代"概念并不等于細(xì)胞生物學(xué)中“親代細(xì)胞"與“子代細(xì)胞"中“代"的概念。傳代培養(yǎng)的實(shí)質(zhì)就是分割后再一次培養(yǎng)，可以相對地衡量培養(yǎng)物的培養(yǎng)年齡。

六、生長曲線:細(xì)胞接種入培養(yǎng)瓶后，先進(jìn)入2-24h的延遲期（lag period），然后進(jìn)入指數(shù)生長期（即對數(shù)期）（log phase），匯合成單層進(jìn)入緩慢生長或停滯期（即平臺期）（plateau lhase）。每種細(xì)胞系（cell line）的這些生長期（growth phase）都是特征性的，只要環(huán)境條件保持恒定，每一次測定結(jié)果應(yīng)該是可重復(fù)的。

第二節(jié) 細(xì)胞分離技術(shù)

一、從原代組織中分離細(xì)胞 將組織塊分離（散）成細(xì)胞懸液的方法有多種，zui常用的是機(jī)械解離細(xì)胞法、酶學(xué)解離細(xì)胞法以及螯合劑解離細(xì)胞法。

從原代組織中獲得單細(xì)胞懸液的一般方法是酶解聚。細(xì)胞暴露在酶中的時(shí)間要盡可能的短，以保持zui大的活性。下列步驟可以解聚整個(gè)組織，獲得較高產(chǎn)量的有活性細(xì)胞。

1.胰蛋白酶 (Trypsin)
●在去除不需要的組織后，使用無菌的解剖刀和剪子把剩余的組織切成3~4mm小片，通過懸浮在無鈣鎂的平衡鹽溶液中清洗組織碎片。讓組織碎片沉淀，去除上清液。重復(fù)清洗2到3次。
●將盛有組織碎片的容器置于冰上，去除殘留的上清液。加入0.25％溶解在無鈣鎂的平衡鹽溶液中的胰蛋白酶（100mg組織加入1ml 胰蛋白酶）。
●在4℃孵育6到18小時(shí)，使幾乎沒有胰蛋白酶活性的酶盡可能滲透進(jìn)去。
●移棄組織碎片中的胰蛋白酶，在37℃孵育包含殘留胰蛋白酶的組織碎片20到30分鐘。
●在組織碎片加入熱的*培養(yǎng)基，用移液管輕輕地分散組織。如果使用無血清培養(yǎng)基，要加入大豆胰蛋白酶抑制劑。
●通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)（100～200mm）過濾，分散所有剩余組織。計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。

2.膠原酶 (Collagenase)
●用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4mm小片，用Hanks'平衡液（HBSS）清洗組織碎片幾次。
●加入膠原酶（50～200單位/ml，溶解在HBSS中）。
●在37℃孵育4到18小時(shí)。加入3mM CaCl2增加解離效率。
●通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，以分離分散細(xì)胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進(jìn)一步的解聚，在碎片中加入新鮮的膠原酶。
●通過離心在HBSS中清洗懸液幾次。
●再一次在培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。

3.Dispase
●用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4mm小片，用不含鈣鎂的平衡鹽溶液清洗組織碎片幾次。
●加入Dispase（0.6～2.4單位/ml 溶解在無鈣鎂的平衡鹽溶液）
●在37℃孵育20分鐘到幾個(gè)小時(shí)。
●通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，以分離分散細(xì)胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進(jìn)一步的解聚，在碎片中加入新鮮的Dispase。
●通過離心在平衡鹽溶液中清洗懸液幾次。
●再一次在培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。

二、從原培養(yǎng)容器中分離細(xì)胞:以下是從基層迅速分離細(xì)胞，且保持細(xì)胞完整性的一般步驟。這一步驟并不意味著對于所有細(xì)胞系的廣泛應(yīng)用，每一種系統(tǒng)*條件和施用濃度應(yīng)該根據(jù)經(jīng)驗(yàn)加以確定。
●再次培養(yǎng)時(shí)檢測細(xì)胞的活性。
●細(xì)胞的活率應(yīng)該超過90％
●對于無血清培養(yǎng)基，降低胰蛋白酶使用量。

1. 移棄使用過的細(xì)胞培養(yǎng)基。

2. 使用不包含有鈣鎂的平衡鹽溶液或EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid，乙二胺四乙酸.)清洗細(xì)胞（看表確定正確的清洗溶液）。在培養(yǎng)瓶對著細(xì)胞的一面加入清洗溶液，通過轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶1到2分鐘清洗細(xì)胞層，然后去除清洗液。

3. 以2～3ml/25cm2的量，加選擇的分離液(見表)到培養(yǎng)瓶對著細(xì)胞的一面。確保分離液覆蓋細(xì)胞層。在37℃孵育培養(yǎng)瓶，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶。通常，在5到15分鐘內(nèi)，細(xì)胞就會(huì)脫落。細(xì)胞分離需要的時(shí)間因細(xì)胞系不同而有所變化。仔細(xì)監(jiān)測細(xì)胞分離過程，避免細(xì)胞受損傷。對難于從培養(yǎng)瓶基層分離的細(xì)胞系，可以輕輕敲打，以加速分離過程。

4. 當(dāng)細(xì)胞*分離時(shí)，垂直放置培養(yǎng)瓶，讓細(xì)胞流到培養(yǎng)瓶的底部。在培養(yǎng)瓶中加入*培養(yǎng)基，通過移液管在單層細(xì)胞表面反復(fù)吹打來分散細(xì)胞。計(jì)數(shù)并再次培養(yǎng)細(xì)胞。

5. 對于無血清培養(yǎng)基，加入大豆胰蛋白酶抑制劑。通常使用1∶1（v∶v）0.25mg/ml胰蛋白酶抑制劑到胰蛋白酶中將抑制胰蛋白酶活性。

第三節(jié) 細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇

為了防止因污染或技術(shù)原因使長期培養(yǎng)功虧一簣，考慮到培養(yǎng)細(xì)胞因傳代而遲早會(huì)出現(xiàn)變異，有時(shí)因寄贈(zèng)、交換和購買，培養(yǎng)細(xì)胞從一個(gè)實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)運(yùn)到另一個(gè)實(shí)驗(yàn)室，*的策略是進(jìn)行低溫保存。這對于維持一些特殊細(xì)胞株的遺傳特性極為重要?，F(xiàn)簡要介紹深低溫保存法(－70℃~－196℃)的特點(diǎn)。細(xì)胞深低溫保存的基本原理是：在－70℃以下時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的酶活性均己停止，即代謝處于*停止?fàn)顟B(tài)，故可以長期保存。細(xì)胞低溫保存的關(guān)鍵，在于通過0~20℃階段的處理過程。在此溫度范圍內(nèi)，水晶呈針狀，極易招致細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。

一、細(xì)胞的凍存:為避免污染造成的損失，zui小化連續(xù)細(xì)胞系的遺傳改變和避免有限細(xì)胞系的老化和轉(zhuǎn)化，需要凍存哺乳細(xì)胞。凍存細(xì)胞前，細(xì)胞應(yīng)該特性化并檢查是否污染。

有幾種普通培養(yǎng)基用來凍存細(xì)胞。對于包含有血清的培養(yǎng)基，成分可能如下：
◆包含10％甘油的*培養(yǎng)基，
◆包含10％二甲基亞砜（DMSO）的*培養(yǎng)基，
◆50％ 細(xì)胞條件培養(yǎng)基和50％含有10％甘油的新鮮培養(yǎng)基，或
◆50％ 細(xì)胞條件培養(yǎng)基和50％含有10％二甲基亞砜的新鮮培養(yǎng)基。
對于無血清培養(yǎng)基，一些普通的培養(yǎng)基成分可能是：
◆50％ 細(xì)胞條件無血清培養(yǎng)基和50％包含有7.5％二甲基亞砜的新鮮的無血清培養(yǎng)基，或
◆包含有7.5％二甲基亞砜和10％細(xì)胞培養(yǎng)級BSA的新鮮無血清培養(yǎng)基。

1.懸浮細(xì)胞
●計(jì)數(shù)將要凍存的活細(xì)胞。細(xì)胞應(yīng)該處于對數(shù)生長期。以大約200～400g離心5分鐘沉淀細(xì)胞，使用移液管移去上清到zui小體積，不要攪亂細(xì)胞。
●以1×107到5×107細(xì)胞/ml密度，在包含有血清的冷凍培養(yǎng)基中再次懸浮細(xì)胞，或者以0.5×107到1×107在無血清培養(yǎng)基中，再次懸浮細(xì)胞。
●分裝進(jìn)凍存管，將凍存管置于濕冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟。
●細(xì)胞以1℃/分鐘進(jìn)行冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進(jìn)行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存。

2.貼壁細(xì)胞
●使用分離試劑從基層分離細(xì)胞，分離時(shí)盡可能溫和，使對細(xì)胞的損傷減少到zui小。
●在*生長培養(yǎng)基中，再次懸浮分離細(xì)胞，確定有活力細(xì)胞數(shù)。
●以大約200g離心5分鐘沉淀細(xì)胞。使用移液管移去上清到zui小體積，不要攪亂細(xì)胞。
●以5×106到1×106細(xì)胞/ml密度，在凍存液中懸浮細(xì)胞。
●分裝進(jìn)凍存管，將凍存管置于濕的冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟。
●細(xì)胞以1℃/分鐘進(jìn)行冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進(jìn)行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存。

二、凍存細(xì)胞的復(fù)蘇:凍存細(xì)胞較脆弱，要輕柔操作。凍存細(xì)胞要快速融化，并直接加入*生長培養(yǎng)基中。若細(xì)胞對凍存劑（DMSO或甘油）敏感，離心去除凍存培養(yǎng)基，然后加入*生長培養(yǎng)基中。

1.直接鋪板方法
●取出貯存細(xì)胞，37℃水浴中快速融化。
●直接用*生長培養(yǎng)基鋪板細(xì)胞。1ml凍存細(xì)胞使用10~20ml*生長培養(yǎng)基。進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞接種應(yīng)該至少在3×105活細(xì)胞/ml。
●培養(yǎng)細(xì)胞12到24小時(shí)，更換新鮮的*生長培養(yǎng)基，去除凍存劑。
2.離心方法
●取出貯存細(xì)胞，37℃水浴中快速融化。
●把1到2ml凍存細(xì)胞加入到大約25ml*生長培養(yǎng)基，輕輕混勻。
●以大約80x g離心2到3分鐘。
●棄去上清。
●在*生長培養(yǎng)基輕輕再次懸浮細(xì)胞，并且進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。
●細(xì)胞鋪板，細(xì)胞接種應(yīng)該至少為3×105活細(xì)胞/ml。

三、細(xì)胞的分化、衰老與死亡

1．細(xì)胞的分化:一個(gè)成年人全身細(xì)胞總數(shù)約1012個(gè)，可以區(qū)分為200多種不同類型的細(xì)胞：形態(tài)結(jié)構(gòu)，代謝，行為，功能等各不相同。追根溯源，這么多種細(xì)胞均來自一個(gè)受精卵細(xì)胞。所以，通常把發(fā)育過程中，細(xì)胞后代在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)生差異的過程稱為細(xì)胞分化。細(xì)胞分化發(fā)生在胚胎階段，也發(fā)生在胎兒出生以后，乃至成人階段。例如，人體血細(xì)胞的產(chǎn)生和分化，這個(gè)過程在人的一生中一直持續(xù)著。

由旺盛生長不斷分裂的細(xì)胞，轉(zhuǎn)入分化，通常從細(xì)胞周期中G1期開始時(shí)一個(gè)確定的點(diǎn)G0點(diǎn)“逃逸"出細(xì)胞周期。旺盛生長分裂的細(xì)胞和各種分化了的細(xì)胞，它們的基因表達(dá)和代謝活動(dòng)各不相同。

2．細(xì)胞的衰老:體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明：

成纖維細(xì)胞：來自胎兒傳代50次后衰老死亡,來自成人傳代20次后衰老死亡(與具體年齡有關(guān));來自小鼠傳代14--28次后衰老死亡,來自烏龜傳代90--125次后衰老死亡。

細(xì)胞衰老過程中會(huì)發(fā)生一系列的變化，包括：蛋白質(zhì)合成速度降低，已有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，特異蛋白質(zhì)成份出現(xiàn)；同時(shí)，細(xì)胞核，線粒體，膜系統(tǒng)、骨架系統(tǒng)等都有結(jié)構(gòu)、功能的改變。

細(xì)胞衰老原因，尚無定論，出現(xiàn)過好幾種理論與假說，其中得到較廣泛認(rèn)可的是“自由基損傷假說"。

3．細(xì)胞凋亡:細(xì)胞的死亡是個(gè)體存活的正?，F(xiàn)象，常見的細(xì)胞死亡形式有3種：壞死、凋亡和細(xì)胞毒性。多細(xì)胞生物的生命活動(dòng)中，因?yàn)榄h(huán)境因素的突然變化或病原物的入侵，導(dǎo)致一部分細(xì)胞死去，稱為細(xì)胞的病理死亡，或細(xì)胞壞死。壞死是細(xì)胞暴露于嚴(yán)重的物理或化學(xué)刺激時(shí)導(dǎo)致的細(xì)胞死亡；細(xì)胞毒性是由細(xì)胞或者化學(xué)物質(zhì)引起的單純的細(xì)胞殺傷事件，不依賴于其它兩種細(xì)胞死亡機(jī)理，如殺傷T細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。

還有一種情況，一部分細(xì)胞的死亡是生物個(gè)體正常生命活動(dòng)（代謝、生長、發(fā)育、分化）的一個(gè)必要部分；似乎帶有“犧牲局部，保全整體"的意味。這種情況下的細(xì)胞死亡，明顯地受遺傳控制，稱為細(xì)胞凋亡。 凋亡（Apoptosis）則是程序性的、正常的細(xì)胞死亡，是機(jī)體清除無用的或者不想要的細(xì)胞的手段。它與細(xì)胞壞死是兩個(gè)截然不同的過程，無論從形態(tài)學(xué)、生物學(xué)還是生化的特征來說，都有明顯的區(qū)別。細(xì)胞凋亡現(xiàn)象普遍存在于生物界。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖、分化和衰老起著互補(bǔ)與平衡的作用，在多細(xì)胞動(dòng)物的發(fā)育、形態(tài)建成與維持中扮演至關(guān)重要的角色。作為細(xì)胞的一種基本生命現(xiàn)象，凋亡失控的結(jié)果將是可怕的：凋亡不足時(shí)，易發(fā)生癌變、病毒性疾病和自身免疫疾?。欢蛲鲞^量則可能產(chǎn)生獲得性免疫缺陷綜合征（HIV）、重癥肝炎與退行性神經(jīng)疾病，如老年性癡呆癥（Alzheimer's disease）、帕金森氏癥（Parkinson's disease）。因此研究細(xì)胞凋亡及其機(jī)理具有重要的理論和實(shí)踐意義。

細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別

壞死

形態(tài)學(xué)特征-膜完整性喪失,胞漿和線粒體膨脹 ,全細(xì)胞裂解

生化特征-離子內(nèi)環(huán)境失調(diào),非能量依賴性的（被動(dòng)過程，在4°C也可以發(fā)生）,隨機(jī)消化DNA（電泳顯示為DNA彌散狀態(tài)）,Postlytic DNA斷裂

生理學(xué)特征-影響群組細(xì)胞 由非生理學(xué)因素引起（如補(bǔ)體攻擊、代謝中毒、缺氧等）,被巨噬細(xì)胞吞噬, 周圍有明顯的炎癥反應(yīng)

凋亡

形態(tài)學(xué)特征-胞膜出芽，但保持完整,染色體聚集在核膜周邊,胞漿收縮、細(xì)胞核凝集,zui后細(xì)胞分裂為凋亡小體,Bcl-2家族蛋白導(dǎo)致線粒體膜通透性增加

生化特征--ATP依賴性的（主動(dòng)過程，在4°C不能發(fā)生）,以核小體為單位剪切DNA（電泳顯示為DNA ladder）,Prelytic DNA 斷裂,線粒體釋放多種因子至胞漿中（細(xì)胞色素c、AIF）,Caspases級聯(lián)活化,膜對稱性改變（PS外翻）

生理學(xué)特征--只影響單個(gè)細(xì)胞 ,由生理學(xué)刺激誘導(dǎo)（如生長因子缺乏、激素環(huán)境改變等）,被臨近細(xì)胞和巨噬細(xì)胞吞噬 無炎癥反應(yīng)

第四節(jié) 細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力測定

一、原理 培養(yǎng)的細(xì)胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好，所以要進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示。細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理和方法與血細(xì)胞計(jì)數(shù)相同。

在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力，由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對細(xì)胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。

用臺盼蘭染細(xì)胞，死細(xì)胞著色，活細(xì)胞不著色，從而可以區(qū)分死細(xì)胞與活細(xì)胞。利用細(xì)胞內(nèi)某些酶與特定的試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，也可測定細(xì)胞相對數(shù)和相對活力。

二、儀器、用品與試劑

1、儀器與用品：普通顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板、試管、吸管、酶標(biāo)儀（或分光光度計(jì)）
2、試劑：0.4％臺盼蘭，0.5％四甲基偶氮唑鹽（MTT）、酸化異丙醇
3、材料：細(xì)胞懸液

三、操作步驟

（一）細(xì)胞計(jì)數(shù)
1、將血球計(jì)數(shù)板及蓋片用擦試干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。
2、將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間。
3、靜置3分鐘。
4、鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按下式計(jì)算：
細(xì)胞數(shù)/ml＝4大格細(xì)胞總數(shù)/ 4×10000
注意：鏡下偶見由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。

（二）細(xì)胞活力
1、將細(xì)胞懸液以0.5ml加入試管中。
2、加入0.5ml 0.4%臺盼蘭染液，染色2一3分鐘。
3、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。
4、鏡下取幾個(gè)任意視野分別計(jì)死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)，計(jì)細(xì)胞活力。
死細(xì)胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細(xì)胞，活細(xì)胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。
活力測定可以和細(xì)胞計(jì)數(shù)合起來進(jìn)行，但要考慮到染液對原細(xì)胞懸液的加倍稀釋作用。

（三）MTT法測細(xì)胞相對數(shù)和相對活力
活細(xì)胞中的琥珀酸脫氫酶可使MTT分解產(chǎn)生蘭色結(jié)晶狀甲贊顆粒積于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞周圍。其量與細(xì)胞數(shù)呈正比，也與細(xì)胞活力呈正比。
l、細(xì)胞懸液以1000rpm離心10分鐘，棄上清液。
2、沉淀加入0.5－1ml MTT，吹打成懸液。
3、37℃下保溫2小時(shí)。
4、加入4—5 ml酸化異丙醇（定容）。打勻。
5、1000 rpm離心，取上清液酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)570nm比色，酸化異丙醇調(diào)零點(diǎn)。

注意：MTT法只能測定細(xì)胞相對數(shù)和相對活力，不能測定細(xì)胞數(shù)。

第五節(jié) 細(xì)胞的分裂指數(shù)

一、原理:體外培養(yǎng)細(xì)胞生長、分裂繁殖的能力，可用分裂指數(shù)來表示。它與生長曲線有一定的，如隨著分裂指數(shù)的不斷提高，細(xì)胞也就進(jìn)入了指數(shù)生長期。分裂指數(shù)指細(xì)胞群體中分裂細(xì)胞所占的百分比，它是測定細(xì)胞周期的一個(gè)重要指標(biāo)，也是不同實(shí)驗(yàn)研究選擇細(xì)胞的重要依據(jù)。

二、儀器、用品與試劑

1、儀器與用品：CO2培養(yǎng)箱、普通顯微鏡、細(xì)胞培養(yǎng)血、蓋玻片、吸管
2、試劑：培養(yǎng)液、胰酶、甲醇、冰醋酸、Giemsa染液

三、操作步驟

1、消化細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接至內(nèi)含蓋玻片的培養(yǎng)皿中。
2、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，使細(xì)胞長在蓋片上。
3、取出蓋片，按下列順序操作：
PBS漂洗3分鐘→甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定30分鐘→Giemsa液染色10分鐘→自來水沖洗。
4、蓋片晾干后反扣在載玻片上，鏡檢。
5、計(jì)算:
分裂指數(shù)=分裂細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%

四、注意事項(xiàng);操作時(shí)動(dòng)作要輕，以免使蓋片上的細(xì)胞脫落。

第六節(jié) 細(xì)胞周期的測定

一、原理:細(xì)胞周期指細(xì)胞一個(gè)世代所經(jīng)歷的時(shí)間。從一次細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束為一個(gè)周期。細(xì)胞周期反應(yīng)了細(xì)胞增殖速度。

單個(gè)細(xì)胞的周期測定可采用縮時(shí)攝影的方法，但它不能代表細(xì)胞群體的周期，故現(xiàn)多采用其他方法測群體周期。測定細(xì)胞周期的方法很多，有同位素標(biāo)記法、細(xì)胞計(jì)數(shù)法等，這里介紹一種利用BrdU滲入測定細(xì)胞周期的方法。
BrdU（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）加入培養(yǎng)基后，可做為細(xì)胞DNA復(fù)制的原料，經(jīng)過兩個(gè)細(xì)胞周期后，細(xì)胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將占l/2，反映在染色體上應(yīng)表現(xiàn)為一條單體淺染。如經(jīng)歷了三個(gè)周期，則染色體中約一半為兩條單體均淺染，另一半為一深一淺。細(xì)胞如果僅經(jīng)歷了一個(gè)周期，則兩條單體均深染。計(jì)分裂相中各期比例，就可算出細(xì)胞周期的值。

二、儀器、用品與試劑

1、儀器、用品：同常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)
2、試劑：BrdU（1.0mg/ml），甲醇、冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2×SSC液

三、操作步驟

1、細(xì)胞生長至指數(shù)期時(shí)，向培養(yǎng)液中加入BrdU，使zui終濃度為10μg/ml。
2、44小時(shí)加秋水仙素，使每ml中含0.1μg。
3、48小時(shí)后常規(guī)消化細(xì)胞至離心管中，注意培養(yǎng)上清的漂浮細(xì)胞也要收集到離心管中。
4、常規(guī)染色體制片（見第三部分：染色體技術(shù)）。
5、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上，鋪上2×SSC 液，距紫外燈管6cm處紫外照射30分鐘。
6、棄去2×SSC液，流水沖洗。
7、Giemsa液染色10分鐘，流水沖洗，晾干。
8、鏡檢100個(gè)分裂相，計(jì)*、二、三、四細(xì)胞期分裂指數(shù)。
9、計(jì)算：
細(xì)胞周期（Tc）=48/{（M1+2M2+3M3+4M4）/100}（小時(shí)）

第七節(jié) 培養(yǎng)物的污染及防止

按現(xiàn)代的觀念，凡是混入培養(yǎng)環(huán)境中對細(xì)胞生存產(chǎn)生有害的成分和造成細(xì)胞不純的異物都應(yīng)該視為污染。根據(jù)這一概念，組織培養(yǎng)污染物應(yīng)包括生物（真菌、細(xì)菌、病毒和支原體）、化學(xué)物質(zhì)（影響細(xì)胞生存、非細(xì)胞所需的化學(xué)成分）、細(xì)胞（非同種的其他細(xì)胞）。其中一微生物zui為多見。另外，隨著使用細(xì)胞種類增多，不同細(xì)胞交叉污染，尤其是Hela細(xì)胞的污染也時(shí)有發(fā)生，從而造成細(xì)胞不純。

一、污染途徑 污染物，特別是微生物常通過下列途徑進(jìn)入培養(yǎng)體系，造成污染

1 空氣：空氣是微生物及塵埃顆粒傳播的主要途徑?？諝饬鲃?dòng)性大，如果培養(yǎng)操作場地于外界隔離不嚴(yán)格或消毒不充分，外界不潔空氣很容易進(jìn)入造成污染。因此，培養(yǎng)設(shè)施不能設(shè)在通風(fēng)場所。無菌操作應(yīng)在凈化臺內(nèi)進(jìn)行，工作時(shí)要帶口罩，以免因講話、咳嗽等使外界污染進(jìn)入操作面，造成污染。

2 器材：各種培養(yǎng)器皿、器械消毒不*和洗刷不干凈導(dǎo)致污染，另外需要對培養(yǎng)箱進(jìn)行定期消毒，防止形成污染

3 操作：實(shí)驗(yàn)操作無菌觀念不強(qiáng)，技術(shù)不熟練，使用污染的器皿或封瓶不嚴(yán)等，都可以造成污染。培養(yǎng)兩種細(xì)胞以上時(shí)，操作不規(guī)范，交叉使用吸管或培養(yǎng)液、瓶等有可能導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。

4 血清：有些血清在生產(chǎn)時(shí)就已經(jīng)被支原體或病毒等污染，變成了污染。

5 組織樣本：原代培養(yǎng)的污染多數(shù)來源于組織樣本；取材時(shí)碘酒消毒后脫碘不*，可造成碘混入組織，細(xì)胞或培養(yǎng)液中，影響細(xì)胞細(xì)胞生長。

二、污染對培養(yǎng)細(xì)胞的影響及污染的檢測

由于體外培養(yǎng)細(xì)胞自身沒有抵抗污染的能力，而且培養(yǎng)基中的抗生素抗污染能力有限，因而培養(yǎng)細(xì)胞一旦發(fā)生污染多數(shù)將無法挽回。細(xì)胞污染早期或污染程度較輕時(shí)，如果能及時(shí)去除污染物，部分細(xì)胞有可能恢復(fù)、但是當(dāng)污染物持續(xù)存在培養(yǎng)環(huán)境中，輕者細(xì)胞生長緩慢，分類象減少，細(xì)胞變得粗糙，輪廓增強(qiáng)細(xì)胞漿出現(xiàn)顆粒、污染較嚴(yán)重，細(xì)胞增值停止，分裂象消失，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大量堆積物，細(xì)胞變圓、脫壁。

（一）細(xì)菌污染對培養(yǎng)細(xì)胞的影響及污染物的檢測

常見的污染細(xì)菌有大腸桿菌、假單孢菌、葡萄球菌等。細(xì)菌污染初期由于培養(yǎng)體系的抗生素作用，其繁殖處于抑制狀態(tài)，細(xì)胞生長不受明顯影響，污染情況用倒置顯微鏡觀察不易判斷。懷疑培養(yǎng)細(xì)胞有細(xì)菌污染時(shí)，取10ml細(xì)胞懸液離心1000轉(zhuǎn)5分鐘，沉淀中加入無抗生素培養(yǎng)液2ml,將細(xì)胞放培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

如果培養(yǎng)無真的細(xì)菌污染，24小時(shí)內(nèi)可以獲得陽性結(jié)果。當(dāng)污染的細(xì)菌量比較大或者細(xì)菌增殖到一定基數(shù)時(shí)，大約每20分鐘一代，會(huì)使培養(yǎng)系統(tǒng)中很快產(chǎn)生大量細(xì)菌，后者不僅可以消耗培養(yǎng)系統(tǒng)中的養(yǎng)分，還能釋放大量代謝產(chǎn)物。幾個(gè)小時(shí)后，增殖的細(xì)菌就可以導(dǎo)致培養(yǎng)液外觀渾濁，肉眼就可以判斷。細(xì)菌污染大多數(shù)可以改變培養(yǎng)液pH，使培養(yǎng)液變渾濁、變色。用相差顯微鏡觀察，可見滿視野都是點(diǎn)狀的細(xì)菌顆粒，原來的清晰培養(yǎng)背景變得模糊，大量的細(xì)菌甚至可以覆蓋細(xì)胞，對細(xì)胞的生存構(gòu)成威脅。用青霉素、鏈霉素可以預(yù)防細(xì)菌污染有效。

（二）真菌污染對細(xì)胞的影響及污染物的檢測

微生物污染中以真菌zui多，真菌種類繁多，形態(tài)各異，但是污染后易于發(fā)現(xiàn)，大多呈白色或淺黃色小點(diǎn)漂浮于培養(yǎng)液表面，肉眼可見；有的散在生長，鏡下可見呈絲狀、管狀、樹枝狀，縱橫交錯(cuò)穿行于細(xì)胞之間。念珠菌和酵母菌卵圓形，散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間生長。真菌生長迅速，能在短時(shí)間內(nèi)抑制細(xì)胞生長、產(chǎn)生有毒物質(zhì)殺死細(xì)胞?？拐婢苿︻A(yù)防和排除真菌污染有效。

（三）支原體污染對細(xì)胞影響及污染物的檢測

細(xì)胞培養(yǎng)（特別是傳代細(xì)胞）被支原體污染是個(gè)世界性問題,是細(xì)胞培養(yǎng)zui常見的、干擾試驗(yàn)結(jié)果的一種污染。但由于不易被察覺，有些污染的細(xì)胞仍在被應(yīng)用。研究表明，95％以上是以下四種：口腔支原體（M.orale）、精氨酸支原體（M.arginini）、豬鼻支原體（M.hyorhinis）和萊氏無膽甾原體（A.laidlawii），為牛源性。以上是zui常見的污染細(xì)胞培養(yǎng)的支原體菌群，但能夠污染細(xì)胞的支原體種類是很多的，國外調(diào)查證明，大約有二十多種支原體能污染細(xì)胞，有的細(xì)胞株可以同時(shí)污染兩種以上的支原體。據(jù)查，目前各實(shí)驗(yàn)室使用的二倍體細(xì)胞和傳代細(xì)胞中約有11%的細(xì)胞受到支原體污染。

污染來源包括工作環(huán)境污染、操作者本身污染（一些支原體在人體是正常菌群）、培養(yǎng)基污染、污染支原體的細(xì)胞造成的交叉污染、實(shí)驗(yàn)器材帶來的污染和用來制備細(xì)胞的原始組織或器官的污染。支原體污染后，因?yàn)樗鼈儾粫?huì)使細(xì)胞死亡可以與細(xì)胞長期共存，培養(yǎng)基一般不發(fā)生渾濁，細(xì)胞無明顯變化，外觀上給人以正常感覺，實(shí)則細(xì)胞手到多方面潛在影響，如引起細(xì)胞變形，影響DNA合成，抑制細(xì)胞生長等。

細(xì)胞培養(yǎng)中，主要從以下幾個(gè)方面來預(yù)防支原體的污染：
控制環(huán)境污染；
嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)操作；
細(xì)胞培養(yǎng)基和器材要保證無菌；
在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入適量的抗生素。
支原體污染細(xì)胞后，特別是重要的細(xì)胞株，有必要清除支原體，常用方法有抗生素處理、抗血清處理、抗生素加抗血清和補(bǔ)體聯(lián)合處理。支原體zui突出的結(jié)構(gòu)特征是沒有細(xì)胞壁，一般來講，對作用于細(xì)胞壁生物合成的抗生素，如 -內(nèi)酰胺類、萬古霉素等*不敏感；對多粘菌素（polymycin）、利福平、磺胺藥物普遍耐藥。對支原體zui有抑制活性及常用于支原體感染治療的抗生素是四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類及一些氟喹諾酮；其他類抗生素如氨基糖苷類、氯霉素對支原體有較小抑制作用，所以常不用來作為支原體感染的化學(xué)治療劑。

（四）細(xì)胞交叉污染對細(xì)胞的影響及污染物的檢測

細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞間交叉污染并不罕見，多是由于在培養(yǎng)中操作時(shí)各種細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行，混雜使用器皿和液體所致，這種污染能使細(xì)胞的生長特性、形態(tài)特征等發(fā)生變化，有些變化較輕、不易察覺，有些可能由于污染的細(xì)胞具有生長優(yōu)勢zui終壓過原來細(xì)胞而導(dǎo)致細(xì)胞的生長抑制，zui終死亡。常用觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)、分析生長特性和核型、檢測細(xì)胞的標(biāo)記物等方法檢測交叉污染的細(xì)胞。

三、污染的預(yù)防:防止污染，預(yù)防是關(guān)鍵，預(yù)防措施應(yīng)該貫穿整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)的始終。

1.器皿準(zhǔn)備中的預(yù)防：用于細(xì)胞培養(yǎng)的器皿應(yīng)該嚴(yán)格消毒，做到真正潔凈；應(yīng)該無菌的物品，要做到消毒嚴(yán)格、真正無菌；器皿的運(yùn)輸、貯存過程中，要嚴(yán)格操作，謹(jǐn)防污染。

2.開始操作前的預(yù)防：應(yīng)當(dāng)按廠家規(guī)定，定期清洗或更換超凈臺的空氣濾網(wǎng)，請專職人員定期檢查超凈臺的空氣凈化標(biāo)準(zhǔn)；檢查培養(yǎng)皿是否有消毒標(biāo)志，有條件得實(shí)驗(yàn)室可以使用一次性用品；檢查新配置的培養(yǎng)液，確認(rèn)無菌方可使用；操作前提前半小時(shí)啟動(dòng)超凈臺的紫外燈消毒；操作應(yīng)戴口罩，消毒雙手。

3.操作過程中的預(yù)防；主要包括：超凈臺內(nèi)放置的所有培養(yǎng)瓶瓶口不能與風(fēng)向相逆，不允許用手觸及器皿的無菌部分，如瓶口和瓶塞內(nèi)側(cè)；在安裝吸管冒、開啟或封閉瓶口操作時(shí)要經(jīng)過酒精燈燒灼，并在火焰附件工作；吸取培養(yǎng)液、細(xì)胞懸液等液體時(shí)，應(yīng)專管，防止污染擴(kuò)大或造成培養(yǎng)物的交叉污染；使用培養(yǎng)液前，不易較早開啟瓶口；開瓶后的培養(yǎng)瓶應(yīng)保持斜位，避免直立；不再使用的培養(yǎng)液應(yīng)立即封口；培養(yǎng)的細(xì)胞在處理之前不要過早的暴露空氣中；操作時(shí)不要交談、咳嗽，以防唾沫和呼出氣流引發(fā)污染；操作完畢后應(yīng)將工作臺面整理好，并消毒擦拭工作面，關(guān)閉超凈臺。

4.其他預(yù)防：及早凍存培養(yǎng)物；重要的細(xì)胞株傳代工作應(yīng)有兩個(gè)人獨(dú)立進(jìn)行；購入的未滅活血清應(yīng)采取56度水浴滅活30分鐘使血清的補(bǔ)體和支原體滅活；為了避免誘導(dǎo)抗藥細(xì)菌，應(yīng)定期更換培養(yǎng)系統(tǒng)的抗生素，或盡可能不用抗生素；對新購入的細(xì)胞株應(yīng)加強(qiáng)觀察，防止外來的污染源；定期消毒培養(yǎng)箱。

四、污染的排除:培養(yǎng)的細(xì)胞一旦污染應(yīng)及時(shí)處理，防止污染其他細(xì)胞。通常選高壓滅菌被污染的細(xì)胞，然后棄掉。如果有價(jià)值的細(xì)胞被污染，并且污染程度較輕，可以通過及時(shí)排除污染物，挽救細(xì)胞恢復(fù)正常。常用的排除微生物污染的方法有以下幾種：

1 抗生素排除法：抗生素是細(xì)胞培養(yǎng)中殺滅細(xì)菌的主要手段。各種抗生素性質(zhì)不同，對微生物作用也不同，聯(lián)合應(yīng)用比單用效果好，預(yù)防性應(yīng)用比污染后應(yīng)用好；如果發(fā)生微生物污染后再使用抗生素，常難以*。有的抗生素對細(xì)菌僅有抑制作用，無殺滅效應(yīng)。反復(fù)使用抗生素還能使微生物產(chǎn)生耐藥性，而且對細(xì)胞本身也有一定影響，因此有人主張盡量不用抗生素處理，當(dāng)然，一些有價(jià)值的細(xì)胞被污染后，仍需要用抗生素挽救，在這種情況下，可采用5－10倍于常用量的沖擊法，加入高濃度抗生素后作用24－48小時(shí)，再換入常規(guī)的培養(yǎng)液，有時(shí)可以奏效。

2 加溫除菌：根據(jù)支原體耐熱性能差的特點(diǎn)。有人將受支原體污染的細(xì)胞置于41度中作用5－10小時(shí)（zui長可以達(dá)18小時(shí)）殺滅支原體。但是41度對細(xì)胞本身應(yīng)有較大影響，故在處理前，應(yīng)先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，確定zui大限度殺傷支原體而對細(xì)胞影響較小的處理時(shí)間。

3 動(dòng)物體內(nèi)接種：受微生物污染的腫瘤細(xì)胞可以接種到同種動(dòng)物皮下或腹腔，借動(dòng)物體內(nèi)免疫系統(tǒng)消滅掉微生物，腫瘤細(xì)胞卻能在體內(nèi)生長，待一定時(shí)間，從體內(nèi)取出再進(jìn)行培養(yǎng)繁殖。

4 與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)：在良好的體外培養(yǎng)條件下巨噬細(xì)胞可以存活7－10天，并可以分泌一些細(xì)胞因子支持其他細(xì)胞的科隆生長。與體內(nèi)情況相似，巨噬細(xì)胞在體外條件下仍然可以吞噬微生物并將其消化。利用96孔板將極少培養(yǎng)細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，可以在高度稀釋培養(yǎng)細(xì)胞、極大地降低微生物污染程度地同時(shí)，更有效地發(fā)揮巨噬細(xì)胞清除污染地效能。本方法與抗生素聯(lián)合應(yīng)用效果更佳。